利用顯微鏡推動發(fā)育生物學、細胞信號轉(zhuǎn)導、衰老和神經(jīng)科學與elegans（線蟲）的發(fā)展

本指南概述了可以高效進行線蟲研究的顯微鏡技術。線蟲是一種廣泛使用的模式生物，與人類有大約70%的基因同源性，是研究發(fā)育、神經(jīng)科學、遺傳學和衰老的理想生物。它的透明性和易培育性使其成為一個出色的遺傳學模型系統(tǒng)。它可以進行高分辨率成像。主要的實驗方法包括揀蟲、轉(zhuǎn)基因、熒光篩選、成像和記錄。

顯微鏡和線蟲研究

顯微鏡是研究線蟲的工具。在這些步驟中都會用到它們：

1、“揀蟲"：用金屬挑針從瓊脂平板上挑出蟲子，轉(zhuǎn)移到新的平板上進行培養(yǎng)或?qū)嶒灐?/p>

2、通過向線蟲體內(nèi)顯微注射核酸進行轉(zhuǎn)基因（基因改造）。

3、熒光篩選，鑒定表達轉(zhuǎn)染熒光蛋白的轉(zhuǎn)基因線蟲。

4、在實驗過程中對線蟲（從胚胎到成蟲的所有階段）進行成像和記錄。

這些任務通過體視顯微鏡、復合顯微鏡或共聚焦顯微鏡來完成。

來自秀麗隱桿線蟲的細胞表達熒光蛋白SPD5-GFP（指示中心體標記，綠色）和Histon 2B-Cherry（指示細胞核，紅色）。間期細胞中的兩對中心體用白色箭頭標出。該圖像是經(jīng)過ICC（即時計算去噪）和SVCC（小體積計算去噪）處理后的Z-stack的最大投影。

揀蟲

要“挑選"具有適當表型或轉(zhuǎn)基因的個體秀麗隱桿線蟲，或?qū)⒕€蟲從一個平板移到另一個平板，研究人員需要使用立體顯微鏡和一個末端帶有金屬的小工具。

與揀蟲有關的挑戰(zhàn)有：

1. 對比度不夠好時，難以識別線蟲的關鍵解剖細節(jié)。

2. 長時間揀蟲會造成用戶疲勞。

3. 用工具處理線蟲時，顯微鏡物鏡下沒有足夠的空間。

4. 視野不夠大時，找蟲子很麻煩。

不過，徠卡顯微鏡具有以下優(yōu)勢，可以克服這些挑戰(zhàn)：

1. 配備各種對比方法的透射光底座可實現(xiàn)高光學對比度，從而觀察到蟲體細節(jié)。

2. 采用人體工程學模塊，用戶安裝舒適，減少勞累和疲勞。

3. 物鏡下方空間充足，工作距離可達122毫米。

4. 視野更大，更容易發(fā)現(xiàn)線蟲。

瓊脂板上有很多秀麗隱桿線蟲，就像在挑蟲時可能會看到的那樣。

顯微注射轉(zhuǎn)基因

秀麗隱桿線蟲的轉(zhuǎn)基因通常是通過核酸顯微注射完成的。顯微注射通常使用配有注射裝置的倒置復合顯微鏡進行。

對線蟲進行顯微注射面臨著一些挑戰(zhàn)：

1. 對比度不足，無法觀察到線蟲的精細解剖細節(jié)，而這正是進行適當靶向定位所必需的。

2. 沒有足夠的空間使用微型注射器。

3. 設置不穩(wěn)定時振動太大。

為了克服這些挑戰(zhàn)，用戶可以利用徠卡顯微鏡提供的優(yōu)勢：

1. 光學對比方法，如DIC（微分干涉對比）或IMC（集成調(diào)制對比），可清楚地看到注入線蟲的位置。

2. 抗震裝置（防震裝置）穩(wěn)定可靠。

能夠使用精確的操作器（Narishige或Eppendorf）進行微量注射。

3. 表達GFP（綠色熒光蛋白）的轉(zhuǎn)基因秀麗隱桿線蟲。Thunder的圖像由中南大學生命科學學院的L. Ma提供。

熒光篩選

要找到轉(zhuǎn)基因成功的秀麗隱桿線蟲，需要使用立體顯微鏡進行熒光篩選。

線蟲熒光篩選存在一定的挑戰(zhàn)：

1. 熒光信號暗淡，難以觀察熒光轉(zhuǎn)基因。

2. 老線蟲蟲和瓊脂發(fā)出強烈的自發(fā)熒光。

3. 由于視野較小，難以發(fā)現(xiàn)線蟲，導致篩查時間延長。

使用徠卡顯微鏡可以通過以下方式克服這些篩選難題：

1. 采用三光束技術的獨立激發(fā)通道提高了信噪比，適用于體視顯微鏡。

2. 使用專門設計的反射鏡防止自發(fā)熒光，反射鏡可與Leica透射光底座一起使用。

3. 徠卡透射光底座提供大視場和多種對比方法。

一張成年雌雄同體秀麗隱桿線蟲的Thunder拍攝的圖像，展示了其性腺。該線蟲用以下熒光染料進行了染色：DAPI（藍色）指示細胞核，SP56（綠色）指示精子，RME-2（紅色）指示卵母細胞，PGL-1（洋紅色）指示RNA和蛋白質(zhì)顆粒。圖片由德國哈勒馬丁路德大學的C. Eckmann提供。

成像和文件

在篩選和鑒定轉(zhuǎn)基因秀麗隱桿線蟲標本后，高分辨率成像和精確記錄對實驗數(shù)據(jù)分析至關重要。要實現(xiàn)這一目標，需要顯微鏡配備高質(zhì)量的攝像頭或探測器以及兼容的成像軟件。

線蟲成像和記錄方面的主要挑戰(zhàn)是：

1. 由于光散射的原因，在對線蟲更深處的結(jié)構(gòu)成像時會出現(xiàn)焦外模糊的現(xiàn)象。

2. 避免光和熱對線蟲造成傷害。

3. 利用基因編碼報告器觀察活體線蟲的暗淡熒光（包括延時成像）。

使用徠卡顯微鏡可以克服這些挑戰(zhàn)。優(yōu)勢如下：

1. 利用圖像增強功能，將線蟲深處的細節(jié)可視化。

2. 使用高質(zhì)量的光學元件、適當?shù)恼彰鞴庠春挽`敏的相機/探測器，減少光照射，降低對線蟲的傷害。

3. 利用寬場顯微鏡和高靈敏度顯微攝像機的良好單噪比，促進實時成像。

4. 必要時，使用轉(zhuǎn)盤、共聚焦或光片顯微鏡獲取更高分辨率的三維圖像。

研究秀麗隱桿線蟲的神經(jīng)系統(tǒng)：使用徠卡共聚焦顯微鏡拍攝的表達熒光蛋白CFP（青色）、GFP（綠色）、YFP（黃色）和DsRed（紅色）的線蟲圖像。

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