如何利用激光顯微切割技術（LMD）對爪蟾蝌蚪的視神經進行精確一致的橫切        

由于哺乳動物中樞神經系統（CNS）的自我修復能力有限以及傳統損傷模型的不一致性，視神經再生是神經生物學的一大挑戰。相比之下，爪蟾蝌蚪的視神經在受傷后可以再生，因此是研究軸突再生的分子和細胞機制的理想模型。在本應用說明中，我們展示了如何利用激光顯微切割技術（LMD）對蝌蚪的視神經進行精確、一致的橫切，從而開發出適合成像、轉錄組分析和功能恢復研究的高重復性損傷模型。

簡介       

視神經是視網膜和大腦之間的聯系紐帶，由視網膜神經節細胞（RGC）軸突組成。這些軸突的跨度相對較大，其功能是維持視覺過程。在人類等哺乳動物中，視神經在受傷后的自我修復能力非常有限，往往會導致視力完全喪失。要改善這些患者的治療效果，我們首先需要充分了解自然界中的物種神經再生的機制。在青蛙身上，視神經受損后會自發地完全再生并恢復視力。這為我們提供了一個理想的模型系統，以了解成功的視神經再生所涉及的基本機制，并為最終在再生能力不足的物種中使用視力保護療法確定目標途徑。

視神經人工損傷模型面臨的挑戰     

使用解剖顯微鏡手動操作蝌蚪視神經需要高超的顯微外科技術，而且動物體型小且易碎，這對手術操作提出了挑戰。即使使用微型機械手和精細鑷子，人工橫切也是一種侵入性操作，很難在不同操作者之間實現標準化，而且往往會導致很高的死亡率。病灶大小和位置可能會有很大差異，從而導致實驗重復的不一致性。這些技術限制影響了模型的可重復性，降低了下游分析的統計能力。因此，特別是在需要精確控制視神經損傷的空間或時間的研究中，很難得出可靠的結論。    

治療視神經損傷的新型激光顯微切割法     

為了開發一種新的手術模型，LMD7與Xla.Tg（tubb2b：mapt-GFP）Amaya轉基因X. laevis品系一起用于可視化和進行視神經橫斷及隨后的軸突再生。蝌蚪的發育階段為43-46期。在這些階段，蝌蚪是透明的，可用于實時熒光成像。簡言之，蝌蚪被麻醉后，被放置在由4%瓊脂糖制成的特制手術床上，手術床位于腔室載玻片內。蝌蚪的朝向是背朝上平放。使用Leica LMD7軟件中的“測量”工具，在放大5倍的情況下，用349 nm紫外激光切割器在視神經從球狀體出口的遠端約300 μm處橫切每只蝌蚪的左側視神經。用“繪制”工具在視神經上繪制的線接受四次激光脈沖（120 µJ/脈沖），激光功率為55 mW（脈沖頻率 = 2710），采用激光螺旋模式（步數 = 2，步長 = 5 μm，重復次數 = 2），以切割到適當深度并橫切神經。熒光視神經顯像中的缺口確認了切割。然后立即取出蝌蚪，在1X MMR培養基中復原，并用于隨后的下游實驗。

圖 1：新型激光模型可實現精確且可重復的視神經切斷。

A) 使用Xla.Tg (tubb2b: mapt-GFP) Amaya轉基因X. laevis品系的LMD7實驗裝置。

B) 蝌蚪在麻醉后被放置在腔室載玻片內由4%瓊脂糖制成的小型手術臺上，使其背側朝上并保持平坦。

C) GFP通道中術前和術后內源性標記的視神經圖像。術后圖像中熒光間隙表明視神經已成功切斷。

D) 三只蝌蚪的代表性圖像，顯示該模型在精確性和可重復性方面的表現，其視神經均在距離眼睛相同的位置被切斷。

結果     

這種激光顯微切割方法可實現高通量、可重復和微創的視神經橫切，從而在損傷后短時間內實現強大的視網膜神經節細胞（RGC）軸突再生。利用LMD7的精確性，可確保不同生物復制中病變位置的一致性，這對下游分析至關重要。該模型已被應用于通過縱向共焦成像研究軸突動態、繪制結構變性和再生（約14天）的時間表、研究細胞死亡和增殖、評估視覺通路恢復，以及通過RNA-seq描述早期轉錄組反應的特征。此外，該方案還與其他轉基因蝌蚪品系兼容，如表達基因編碼傳感器的蝌蚪品系。例如，Xla.Tg (tubb2b:GCaMP6s)NXR 株系被用來觀察激光損傷開始時視神經中的鈣動態。 

視頻1：切片三天后，觀察到左側視神經損傷部位出現軸突萌芽，而對側神經保持完好。通過徠卡共聚焦顯微鏡從麻醉的爪蟾蝌蚪身上獲取Z疊圖像，從而實現了再生動態的原位可視化。

視頻2：通過Xla.Tg (tubb2b:GCaMP6s)NXR株觀察鈣動態。在激光橫切期間和之后連續進行成像。激光損傷會導致鈣離子迅速進入神經。視頻被加速，熒光強度顯示為熱圖。   

結論     

這種基于LMD激光的方法提供了所需的精確度，可產生一致的病變，同時將脫靶損傷降至最低，克服了人工技術的局限性。因此，它為研究中樞神經系統再生機制提供了一個功能強大且可重復的平臺。該模型可用于未來的定向基因操作實驗，從而擴展再生神經科學研究的工具包。

參考文獻： 

1. Moulin, C.、Dvoriantchikova, G.、Bineshfar, N. 等人. 新型視神經橫斷激光模型為視神經再生動力學提供了寶貴的見解。科學報告 14，27412（2024 年）

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