摘要

本應(yīng)用報(bào)告介紹了如何利用徠卡顯微系統(tǒng)的DM6 B顯微鏡平臺(tái)及其集成的THUNDER高對(duì)比度成像技術(shù)，建立一套高效率、高對(duì)比度、適用于低表達(dá)蛋白檢測的斑馬魚胚胎篩選流程。該技術(shù)基于徠卡的光學(xué)成像系統(tǒng)，可顯著降低厚樣本的焦外模糊，提升圖像對(duì)比度。THUNDER與徠卡的SynapseTM高速觸發(fā)系統(tǒng)、8通道LED照明和K8 sCMOS相機(jī)協(xié)同工作，形成一套便于抽取信息、適用于動(dòng)物模型篩查的標(biāo)準(zhǔn)化成像方法。

1.品牌與技術(shù)背景

1.1 徠卡顯微系統(tǒng)簡介

徠卡顯微系統(tǒng)是一家專注于光學(xué)顯微成像、數(shù)字成像解決方案和樣本分析技術(shù)的專業(yè)制造商。其核心技術(shù)體系包括集成于成像平臺(tái)中的THUNDER高對(duì)比度成像技術(shù)、LIGHTNING反卷積、高端物鏡平臺(tái)以及sCMOS相機(jī)。

1.2 THUNDER技術(shù)定位

徠卡THUNDER是一種集成于其光學(xué)顯微鏡平臺(tái)的高對(duì)比度成像技術(shù)，專為厚組織與3D培養(yǎng)物設(shè)計(jì)。該技術(shù)通過實(shí)時(shí)處理，能有效去除由厚樣本散射引起的焦外模糊，從而顯著提升圖像的熒光對(duì)比度，特別適合斑馬魚胚胎這類厚度較大、散射顯著、熒光表達(dá)差異大的樣本。

2.應(yīng)用背景：斑馬魚胚胎篩選的挑戰(zhàn)

2.1 行業(yè)需求

轉(zhuǎn)基因斑馬魚胚胎廣泛應(yīng)用于發(fā)育生物學(xué)與體積成像實(shí)驗(yàn)（如光片顯微鏡）。篩選是否具有足夠蛋白表達(dá)，是進(jìn)入下游三維成像前的關(guān)鍵步驟。

2.2 傳統(tǒng)技術(shù)的局限性

體視顯微鏡：分辨率和靈敏度不足，低表達(dá)樣本容易被漏判。

傳統(tǒng)寬場顯微鏡：厚樣本下焦外模糊嚴(yán)重，導(dǎo)致對(duì)比度下降。

因此需要一種高對(duì)比度+低光劑量+高速切換+可靠檢測低表達(dá)信號(hào)的成像系統(tǒng)，而這正是徠卡THUNDER的優(yōu)勢所在。

3.徠卡 DM6 B + THUNDER的篩選方法與工作流程

3.1 使用設(shè)備

·       徠卡DM6 B寬場顯微鏡

·       集成THUNDER高對(duì)比度成像功能的圖像處理模塊

·       徠卡K8 sCMOS相機(jī)

·       徠卡SynapseTM高速觸發(fā)系統(tǒng)

·       徠卡pE800 8通道熒光光源

·       徠卡HC APO/HC FLUOTAR系列高數(shù)值孔徑物鏡

3.2 操作流程

步驟1：樣本安裝

將斑馬魚胚胎置于35mm培養(yǎng)皿，適配THUNDER Imager Tissue平臺(tái)。

步驟2：低倍概覽

使用徠卡1.25x/0.04干式物鏡進(jìn)行明場概覽觀察。

步驟3：LAS X Navigator導(dǎo)航

使用徠卡LAS X Navigator軟件標(biāo)注需要進(jìn)一步篩查的ROI。

步驟4：高倍確認(rèn)

切換到高分辨率物鏡，配合低光照、短曝光與高速觸發(fā)，確保內(nèi)源熒光不受光漂白影響。

步驟5：啟用THUNDER高對(duì)比度成像模式

在徠卡LAS X軟件中開啟THUNDER成像模式：

·       基于徠卡光學(xué)系統(tǒng)獲取的圖像數(shù)據(jù)，實(shí)時(shí)去除焦外模糊

·       增強(qiáng)低表達(dá)蛋白的信號(hào)可見度

·       在預(yù)覽階段即可獲得清晰圖像，用于快速判斷

4.篩選結(jié)果與表現(xiàn)

4.1 對(duì)比度提升顯著

徠卡THUNDER高對(duì)比度成像技術(shù)能顯著降低由厚樣本引入的焦外模糊，使熒光結(jié)構(gòu)邊界更清晰，背景噪訊得到有效抑制。

4.2 低表達(dá)信號(hào)也可穩(wěn)定檢測

徠卡K8 sCMOS的高靈敏度與THUNDER成像技術(shù)的背景抑制能力相結(jié)合，可在低光照條件下獲得高信噪比的圖像，非常適合低表達(dá)蛋白篩查。

4.3 全流程高效銜接

“徠卡DM6 B顯微鏡平臺(tái) → Leica LAS X Navigator軟件 → 集成的THUNDER成像功能"形成連續(xù)、快速、可視化強(qiáng)的篩查鏈路。

5. 應(yīng)用場景案例

以下流程均由徠卡顯微系統(tǒng)成像平臺(tái)實(shí)施：

·       使用具備THUNDER成像功能的徠卡THUNDER Imager Tissue系統(tǒng)進(jìn)行低倍概覽與熒光篩查

·       以徠卡K8 sCMOS相機(jī)在555 nm、2% LED強(qiáng)度、150 ms曝光條件下成像，并通過THUNDER模式實(shí)時(shí)增強(qiáng)mKate信號(hào)對(duì)比度

·       研究團(tuán)隊(duì)成功在低表達(dá)條件下識(shí)別目標(biāo)胚胎，減少無效樣本進(jìn)入下游光片體系

6. 結(jié)論：徠卡在斑馬魚篩選中的價(jià)值

徠卡DM6 B顯微鏡與其集成的THUNDER高對(duì)比度成像技術(shù)為斑馬魚胚胎篩選提供：

·       高對(duì)比度、可復(fù)現(xiàn)的熒光成像

·       對(duì)低表達(dá)蛋白的穩(wěn)定檢測能力

·       高速操作流程

·       低光損、適用于后續(xù)活體成像工作流

·       適配多種徠卡物鏡的靈活擴(kuò)展性

此方法可顯著提升實(shí)驗(yàn)流效率，并為光片顯微鏡等3D培養(yǎng)物成像方式提供高質(zhì)量樣本篩選。